大腸桿菌DNA殘留定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
貨號(hào)：71023
 
一. 試劑盒簡(jiǎn)介
大腸桿菌殘留 DNA 檢測(cè)試劑盒是用于定量檢測(cè)各種生物制品及藥品的中間品、半成品和成品中殘留的大腸桿菌 宿主細(xì)胞DNA。本試劑盒利用熒光探針原理，定量檢測(cè)樣本中大腸桿菌殘留DNA檢測(cè)快速，專一性強(qiáng)，性能可靠，最低檢測(cè)限可以達(dá)到 fg 級(jí)別。試劑盒配套有大腸桿菌 DNA定量參考品，已溯源至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。
 
二．試劑盒組份
表 1.試劑盒組份

組份	裝量	數(shù)量	儲(chǔ)存條件
大腸桿菌 DNA 定量參考品	75ng/瓶	1瓶	-20℃
大腸桿菌 qPCR 檢測(cè)試劑 （熒光定量PCR試劑，含ROX校正染料）	680ul/瓶	3瓶	-20℃，避光
復(fù)溶液	1.5ml/瓶	3瓶	2-8℃及以下

 
?  規(guī)格：100 Reactions。
?  有效期: 規(guī)定儲(chǔ)存條件下 12 個(gè)月。
? 
?  已測(cè)試機(jī)型：
?  PRISM? 7500 Real-Time PCR System (ABI)
?  CFX96 (Bio-Rad)
?  LineGene 9600 (博日)
?  Roche 480 Lightcycler
 
三、實(shí)驗(yàn)所需但試劑盒中未含材料
?  1.5ml 無(wú)菌低吸附離心管
?  1000μl，100μl，10μl 無(wú)菌低吸附帶濾芯槍頭
?  相關(guān)設(shè)備
?  熒光定量 PCR 儀
?  1000μl，100μl，10μl 移液槍
? 
四、操作流程
4．1大腸桿菌 DNA 定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
將試劑盒中提供的 大腸桿菌 DNA凍干定量參考品75ng,使用 0.5ml 復(fù)溶液溶解 。之后按照如下步驟依次稀釋至濃度為 150ng/ml、15ng/ml、1.5ng/ml、0.15ng/ml、0.015ng/ml。
具體操作如下：
1.  向試劑盒中提供的 大腸桿菌 DNA 凍干品中加入 0.5mL DNA復(fù)溶液，蓋好膠塞，輕微振蕩混勻，此樣品為ST1。
2.  取 5 支干凈的 1.5ml 離心管，分別標(biāo)記為 ST0 ， ST2， ST3，ST4，ST5。
3.  每管分別加入 90μl DNA 復(fù)溶液。
4.  取 10μl 的  大腸桿菌 DNA 定量參考品 ST1，加入 ST2 管，瞬時(shí)振蕩混勻后短時(shí)間快速離心 5s，重復(fù) 3 次以確保定量參考品與 DNA復(fù)溶液充分混勻。
5.  按表 2 依次進(jìn)行稀釋操作，稀釋步驟同 4。
 表 2. 大腸桿菌 DNA 定量參考品的稀釋

稀釋管	稀釋體積	濃度(ng/ml)
ST1	1瓶DNA 定量參考品+500μl DNA復(fù)溶液	150
ST2	10μl ST1+90μl DNA復(fù)溶液	15
ST3	10μl ST2+90μl DNA復(fù)溶液	1.5
ST4	10μl ST3+90μl DNA復(fù)溶液	0.15
ST5	10μl ST4+90μl DNA復(fù)溶液	0.015
ST0	90μl DNA 復(fù)溶液	0

已融化未使用的 DNA 復(fù)溶液可保存于 -20℃。
 
4.2 加樣回收質(zhì)控 ERC 的制備
根據(jù)需要設(shè)置 ERC 中的  大腸桿菌 DNA 加樣濃度（以制備加0.15 ng/ml   大腸桿菌 DNA 量的樣本 ERC 為例），具體操作如下：
1.  取 100μl 待測(cè)樣本加入 1.5ml 干凈的離心管中。
2.  再加入 10μl ST3，混勻，標(biāo)記為樣本 ERC。
   樣本 ERC 和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成樣本 ERC 純化液。
 
4.3 陰性質(zhì)控 NCS 的制備
根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性質(zhì)控，具體操作如下：
1. 取100μl 樣本基質(zhì)溶液(或DNA 復(fù)溶液)加入 1.5ml 干凈的離心管中標(biāo)記為陰性質(zhì)控 NCS。
   陰性質(zhì)控 NCS 和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控 NCS 純化液。
 
4.4 qPCR 反應(yīng)液的制備和加樣
1.  根據(jù)所要檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣本數(shù)量，計(jì)算所需反應(yīng)孔數(shù)，一般做 3 個(gè)重復(fù)孔/樣。
反應(yīng)孔數(shù)=（5 個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線+ 1 個(gè)無(wú)模板對(duì)照 NTC+ 1 個(gè)陰性質(zhì)控 NCS +待測(cè)樣本×2）×3
   待測(cè)樣本×2 是因?yàn)槲覀兺扑]每個(gè)待測(cè)樣本檢測(cè)時(shí)都應(yīng)同時(shí)做樣本ERC。
2.  從試劑盒內(nèi)取出 大腸桿菌 qPCR 檢測(cè)試劑一管，室溫下使其完全融化。
3.  根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的 大腸桿菌 qPCR MIX 總量：
      大腸桿菌 qPCR MIX =（反應(yīng)孔數(shù)+1）× 20μl（含有 1 孔的損失量）
4.  各試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按表 3 所示加樣： 表 3.各反應(yīng)孔加樣示例

標(biāo)準(zhǔn)曲線	20μl  大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl ST1/ST2/ST3/ST4/ ST5
NTC	20μl  大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl DNA 復(fù)溶液
NCS	20μl  大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl NCS 純化液
待測(cè)樣本	20μl  大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl 待測(cè)樣本純化液
樣本 ERC	20μl  大腸桿菌 qPCR MIX + 5μl 樣本 ERC 純化液

 
   加樣完成后每孔總體積為 25μl。，檢測(cè)試劑含有ROX染料。
 

NTC

S1

S1

S1

S1 ERC

S1 ERC

S1 ERC

A

NTC

S2

S2

S2

S2 ERC

S2 ERC

S2 ERC

ST5

ST5

ST5

B

NTC

S3

S3

S3

S3 ERC

S3 ERC

S3 ERC

ST4

ST4

ST4

C

S4

S4

S4

S4 ERC

S4 ERC

S4 ERC

ST3

ST3

ST3

D

NCS

S5

S5

S5

S5 ERC

S5 ERC

S5 ERC

ST2

ST2

ST2

E

NCS

ST1

ST1

ST1

F

NCS

G

H

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

 
   該示例表示的是檢測(cè)5 個(gè)濃度梯度的 大腸桿菌 DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線（ST1～ST5）、1 個(gè)無(wú)模板對(duì)照 NTC、1 個(gè)陰性質(zhì)控 NCS、5 個(gè)待測(cè)樣本（S1～S5）和每個(gè)樣本的 ERC（S1 ERC～S5 ERC）。每個(gè)檢測(cè)做 3 個(gè)重復(fù)孔。
   實(shí)際檢測(cè)時(shí)可根據(jù)樣本多少，參照此示例進(jìn)行 96 孔板排版加樣。
5.  將 96 孔板用光學(xué)膜封閉，輕微震蕩混勻，短時(shí)間快速離心 10s 后放入 qPCR 儀。
 
五．qPCR 程序參數(shù)設(shè)置
以 AB 公司 7500 qPCR 儀、軟件版本 12.4 3 為例。
1.  創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對(duì)定量檢測(cè)模板。
2.  創(chuàng)建新檢測(cè)探針，命名為  大腸桿菌-DNA，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，猝滅熒光基團(tuán)為 none，檢測(cè)參比熒光為 ROX。
3.  設(shè)置兩步法反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 10min；95℃ 30 s，60℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體積 25μl 。
 
 
六. qPCR 結(jié)果分析
   以 AB 公司 7500 qPCR 儀、軟件版本 12.4 3 為例。
1.  在 Results 的 Amplification Plot 面板中，將 Threshold 設(shè)置為 0.02，點(diǎn)擊 Analyze，此時(shí)可初步查看擴(kuò)增曲線的形態(tài)是否正常。
2.  在 Results 的 Plate 面板中，將標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的 Task 一欄設(shè)置為Standard，并且在 Quantity 一欄分別賦值為15030ng/ml、153ng/ml、1.50.3ng/ml、0.150.03ng/ml、0.0030.015ng/ml，并且在相應(yīng)的 Sample Name 一欄中命名為 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
3.  在 Results 的 Plate 面板中，將無(wú)模板對(duì)照 NTC 孔的 Task 一欄設(shè)置為 NTC，將陰性質(zhì)控 NCS 孔、待測(cè)樣本孔、樣本 ERC 孔的Task 一欄設(shè)置為 Unknown，并且在相應(yīng)的 Sample Name 一欄
中命名為 NTC、NCS、S、ERC，之后點(diǎn)擊 。
4.  在 Results 的 Standard Curve 面板中，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
5.  在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一欄可讀取無(wú)模板對(duì)照NTC、陰性質(zhì)控 NCS、待測(cè)樣本、樣本 ERC 的檢測(cè)值， 單位為ng/ml。后續(xù)可在檢測(cè)報(bào)告中將單位換算為 pg/μl 或pg/ml。
七．其他  
結(jié)果分析的參數(shù)設(shè)置需依據(jù)具體的機(jī)型及使用的軟件版 本，一般也可由儀器自動(dòng)判讀。
    根據(jù)待測(cè)樣本和樣本 ERC 的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算加樣回收率， 加樣回收率要求在 50%～150%之間。
   陰性質(zhì)控 NCS 的 Ct 值應(yīng)大于標(biāo)曲最低濃度 Ct 均值。
   無(wú)模板對(duì)照 NTC 的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為 Undetermined 或 Ct 值≥35。